​案例解析：m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生 | m6A专题

编者按

注意啦注意啦~m6A又发新文章啦~

在4月的《Plant Cell》上刊登了三篇关于植物m6A reader的文章，值得注意的是，三个不同研究课题的研究切入点都是拟南芥YTH结构域蛋白ECT对毛状体发育的影响，可见m6A近期的研究热度持续上涨。

简要看看这三篇文章的研究主题：

1.m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生

2.m6A reader-ECT2通过影响拟南芥中mRNA稳定性来控制毛状体形态

3.YTH结构域蛋白ECT2是拟南芥正常毛状体分枝所需的m6A resder

今天分享的第一篇文章为“m6A-YTH组件调控拟南芥叶片发育时间和形态发生”，探讨了拟南芥YTH结构域蛋白(ECT2/3)在参与调控叶片发生时间和叶片形态发生方面起到重要作用；并且文章探索了干旱胁迫与ECT之间的作用关系，对研究m6A与非生物胁迫具有重要指导意义。

文章信息

论文标题：An m6A-YTH Module Controls Developmental Timing and Morphogenesis in Arabidopsis

发表期刊：Plant cell

影响因子：8.688

刊登日期：2018.4.11

研究机构：哥本哈根大学

摘要

N6-methyladenosine（m6A）是真核生物基因转录后调控的一种重要机制，RNA序列上m6A位点为效应蛋白（readers）提供了结合位点从而影响mRNA前提剪切、mRNA降解和翻译效率。YT521-B同系（YT521-B homollogy，YTH）结构域蛋白是动物中一类重要的m6A 效应蛋白。而在植物中具有比其他真核生物更多的YTH结构域蛋白，但是他们的生物学功能还是未知的。哥本哈根大学的研究团队研究表明拟南芥细胞质YTH结构域蛋白EVOLUTIONARILY CONSERVED C-TERMINAL REGION2/3 (ECT2/3)在参与调控叶片发生时间和叶片形态发生方面起到重要作用。这些功能依赖于ECT2和ECT3与m6A位点的结合，表明于ECT2和ECT3行使了m6A readers的功能。在ECT2和ECT3同时被插入突变以后，继续插入突变ECT2的同系物ECT4，可以进一步延迟叶片发生迟缓和加重叶片形态发生异常。荧光显微观察表明ECT2-4在在幼苗茎尖和新生叶的分叉点表达。同时ECT2和ECT3也在毛状体发育早期高表达，同时依赖与m6A位点的结合调控毛状体形态发生。

结果

图1

作者对拟南芥中已经报道的13个YTH结构包含蛋白做了进化树分析，如图1所示，13个拟南芥YTH结构包含蛋白分为两个分支：11个属于YTHDF分支（ECT1-11），两个属于YTHDC分支。

图2

通过分析已发表的拟南芥表达谱数据，发现ECT2和ECT3在不同类型样本和处理中普遍高表达，作者决定围绕这两个基因开展深入研究。

图3

作者为了研究ECT2和ECT3的功能，采用DNA插入突变的方式构建3个ECT2（ect2-1、ect2-2、ect2-3）突变体和2个ECT3（ect3-1、ect3-2）突变体。qPCR和RNA blot表明3个ECT2突变体和2个ECT3突变体均无法转录出可检测水平的mRNA和蛋白。

图4

作者对获得的ECT2和ECT3单突变植株表型分析发现，和野生型相比，ECT2和ECT3单突变不会影响转化株的叶片表型。

图5

但是当ECT2和ECT3同时被突变后，和野生型比双突植株第一片真叶形成时间明显滞后（图4、图5 I左），通过统计萌发后7-8天叶片大小，显示双突植株叶片全部为小叶片，而单突和野生型植株叶片主要为大叶片（图5 J）。

通过转基因表达ECT2和ECT3后，双突植株的表型可以恢复（图5 I右、图5J），表明ECT2和ECT3参与了拟南芥叶片生成时间的调控。

通过表达ECT2-mCherry和ECT3-Venus蛋白后荧光显微观察，发现ECT2和ECT3主要在牙尖表达（图5K、L）。

因为ECT4和ECT2氨基酸序列同源性高达72%，而且有文献报道ECT4启动子：GUS融合可以激活叶片生成，作者构建了3个ECT4插入突变，其中ect4-2是无效等位基因（图5 M、N）。ect4-2单突变以及ect2-1/ect4-2、 ect3-2/ect4-2双突变均表现正常表型（图4），但是ect2-1/ect3-1/ect4-2三突变植株表现出叶片发生延迟的现象，且延迟程度比ect2/ect3双突变植株更严重（图4、图5 I）。在ect2-1/ect3-1/ect4-2三突变基础上转基因表达ECT4可以使转化植株表型恢复到ect2/ect3双突变植株的表型，表明ECT2、ECT3和ECT4在叶片发生时间调控上起作用。

图6

敲除实验已经证明了ECT2/3/4影响叶片发生时间，但是此影响是否依赖于和甲基化的mRNA结合仍然未知。为了回答这个关键问题，作者首先进行了多个YTH结构域的序列保守型分析，发现与RNA和m6A结合的20个氨基酸中，拟南芥ECT2/3/4序列上具有其中的16个氨基酸以及1个保守氨基酸，其中形成与m6A位点结合的芳香笼（aromatic cage）必需的色氨酸也包含在内（图6 A），通过分析高级结构，发现ETC2和ECT3结构高度保守，它们的空间结构与甲基腺苷配体也不会冲突。表明ETC2-4具有m6A识别能力。

图7

作者进一步作了功能验证，发现ECT2/ECT3/ECT4三敲后补偿表达ECT2^W464 和ECT3^W283（ECT2^W464 和ECT3^W283 无m6A结合能力），没有转化株的表型恢复，与之相比，补偿表达ECT2和ECT3的植株中，70%转化株表型恢复（图7 C、D）。

WB和荧光显微观察表明突变型和野生型ECT2/3在表达量和表达部位没有差别，排除蛋白不稳定等可能原因的干扰（图7E、F），表明ETC2-4通过识别靶m6A位点行使功能。

图8

通过对叶片形态发生分析发现，和影响叶片生成时间一致，ECT2/ ECT3 /ECT4单敲以及ECT2/ ECT4双敲、ECT3 /ECT4双敲不会影响叶片形态发生，但ECT2/ ECT3双敲会影响叶片形态发生，导致叶片呈三角形，叶片底部出现锯齿。恢复表达ECT2和ECT3可以使得表型恢复。在ECT2/ECT3双敲基础上继续敲除ECT4，会进一步影响叶片形态。ECT2/ECT3/ECT4三敲后补偿表达ECT2^W464 和ECT3^W283，叶片表型不会恢复，而补偿表达ECT2和ECT3的植株会恢复叶片表型，表明ETC2-4通过识别靶m6A位点调控叶片发生。

图9

有文献报道种子萌发后发育阶段m6A水平下降会导致毛状体分叉增多，作者对ECT2/ECT3双敲植株莲座叶毛状体分支数进行了统计，发现ECT2/ECT3双敲植株莲座叶毛状体分支数量明显增多（图9A、B）。

为了更准确区分不同基因在调控毛状体形态中的贡献，作者收集了野生型植株、ect2/ect3、ect2-1/ect4-2、 ect3-2/ect4-2双敲植株、ect2-1、ect2-3、ect3-1、ect3-2、ect4-2单敲植株、ect2-1/ect3-1/ect4-2三敲植株的毛状体，每种植株采集大约1000个毛状体统计分支数量，发现ECT3单敲对毛状体分支数影响最大，其次是ECT2，而ECT4对毛状体分支数无影响（图9 B）。

荧光显微观察发现ECT2和ECT3主要在新生毛状体早期发育阶段表达，而在成熟毛状体中不表达（图9 C）。

图10

YTH结构域蛋白在核内和核外表达形式的功能会出现差别，为了确定ECT2/ECT3/ECT4的细胞定位，作者观察根中融合荧光蛋白表达分布，发现ECT2/ECT3/ECT4主要在根分生组织表达（使用根为研究材料是因为根中液泡小，无叶绿体干扰），亚细胞定位与细胞质中（N：nucleus； C：cytoplasm）。

图11

显微观察插入到MS琼脂培养基内部的根细胞的荧光时，发现荧光信号（ECT2、ECT3）绝大部分是弥散的（图10），但是有时会观察到异常的荧光信号模式（图11上），即有些根尖细胞偶尔会出现胞质转化灶（cytoplasmic foci）。而对已生长在培养基表面的根，ECT2定位在转化灶这种现象变得普遍（图11 下）。

图12

为了评估ECT蛋白定位的转化灶是P-bodies，作者共表达了ECT2-mCherry和 GFP-tagged VARICOSE（VARICOSE 是P-body 中脱帽复合体必须的组分），观察发现ECT2板块更大，两种荧光信号间存在重叠，但是ECT2信号大部分还是单独存在，没有和P-bodies共定位（图12 上）。而当培养植物的培养皿盖被移除，10h后再次观察荧光信号，发现本来弥散的ECT2信号被更大更亮的P-bodies信号所覆盖（图12下）

图13

上面提到，生长在培养基表面的根中P-bodies数量更多，而生长在培养基内部的根P-bodies数量少；移除培养皿盖10h后根内P-bodies数量也会增加，这些现象表明干旱压力可能会诱导P-bodies形成。为了验证这个假说，作者使用30% PEG6000处理ECT2/ECT3/ECT4转基因植株，发现干旱胁迫后，ECT2/ECT4转基因植株P-bodies数量明显增多，而ECT3转基因植株没有观察到这种现象。表明压力胁迫下，至少ECT2/ECT4可以定位在P-bodies。

图14

通过预测，发现ECT2/ECT3/ECT4和哺乳动物YTHD蛋白一样，它们N端部分包含内在无序蛋白结构（图14 上），内在无序蛋白的重要生物学功能是他们具有水凝胶性质，可以形成聚合体，这类复合体可能就是亚细胞定位到无膜小体（P-body）的基础。为了验证ECT2是否具有这种特性，作者在大肠杆菌表达了全长ECT-His6-MBP融合蛋白，表达的融合蛋白Ni²⁺亲和色谱纯化后负染、电镜，发现出现了一定大小和形状的复合体（图14 下），这种现象和以前文章报道的一致。

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